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        分子生物學檢測
        熒光定量PCR實驗技術對外服務

        時間:2020-07-21 13:46:00 瀏覽:2485次

         

        一、熒光定量PCR起源

        熒光定量PCR(也稱TaqMan PCR,以下簡稱FQ-PCR)是美國PEPerkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術,該技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的,與變通PCR相比,FQ-PCR具有許多優點。與普通PCR相比,FQ-PCR具有許多優點:1、封閉反應,無需PCR后處理。2、特異性強,靈敏度高。3、采用對數期分析,摒棄終點數據,定量準確。4、定量范圍寬,可達到10個數量級。5、儀器在線式實時檢測,結果直觀,避免人為判斷。6、可實現一管雙檢或多檢。7、操作安全,縮短時間,提高效率。熒光定量 PCR是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。

        熒光定量PCR分類:
        TaqMan熒光探針
        PCR
        擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5-3‘外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
        SYBR Green熒光染料
        SYBR Green
        是一種DNA結合染料,能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下,它不發出熒光,但一旦結合到雙鏈DNA中以后,便可以發出熒光。它的最大優點就是可以與任意引物、模板相配合,用于任意反應體系中。從經濟角度考慮,它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合,所以一旦反應體系中出現非特異擴增,那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素,可以通過選擇良好的引物并優化反應條件以消除非特異性影響。


        ●主要實驗步驟如下

        RT-qPCR是由三個步驟組成:
        1.
        反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
        2.
        擴增:PCR的方法擴增cDNA;
        3.
        檢測:實時檢測和定量擴增的產物.


        二、具體實驗操作步驟:

        1.設計并合成Realtime PCR引物。
        2.
        引物溶解后使用PromegaTaqDNA聚合酶進行含SGSYBR?; Green)的PCR反應的優化。
        3.
        客戶樣品RNA抽提
        實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1mlRNA抽提試劑TrizolInvitrogen),勻漿后抽提RNA。
        實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×1061×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS1mlRNA抽提試劑TrizolInvitrogen),裂解后抽提RNA 。
        4.RNA
        質量檢測
        a.
        紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm280nm處的吸收值,以計算其濃度并評估RNA純度 。
        b.
        使用ambion公司的甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。
        5.
        使用逆轉錄酶(Promega)進行反應,將樣品RNA逆轉錄為cDNA。
        6.
        制備標準曲線樣品:
        進行相對定量,需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增,其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。
        7.
        標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SGRealTime PCR反應液中,進行RealTime PCR擴增和檢測。
        8.
        檢測結果進行標準曲線分析:以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差,所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。
        9.
        提供實驗報告:包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結果的相關圖表 。


        三、熒光定量PCR中的一些術語

        1.CT值:熒光信號有統計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環次數,或者說是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。

        2.閾值:閾值的默認設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。

        3.CT值與起始模板的量成線性關系。

        四、主要儀器設備:

        Sigma 3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司

        ABI ABI 7500熒光定量PCR儀 美國ABI公司

        ZKU-B120超低溫冰箱 中國生命科技股份有限公司

        Millipore 超純水系統 美國MILLIPORE公司

        微量移液槍 Eppendorf公司

        Bio-Rad核酸蛋白測定儀 美國Bio-Rad公司


        五、客戶須知:



        1、請您提供新鮮的且盡量多的材料,或直接提供純化好的總RNADNA(大于5ug/樣本)。如是如織:100200mg

        2、請通過EMAIL提供已知的全長基因序列。Email:huameixinan@163.com

        3、請提供詳細背景資料:DNA/RNA來源,豐度。


        六、結果提供:

        1、實驗詳細步驟,和相關數據。

        2、標準曲線,擴增曲線,溶解曲線。

        3、完整的實驗報告(含軟件分析結果)


        七、最近優惠:

        1、引物合成,費用全免。

        2、免費提供3次重復的實驗結果。

        3、引物和探針設計免費。

        4、RNA抽提費用全免。

        5、免費提供RNA保護試劑,上門服務取樣。


        八、實驗完成時間:

        30個工作日


        九、威斯騰服務流程:



        十、威斯騰生物服務項目:

        分子生物學檢測 蛋白質與免疫學 動物實驗
        實時熒光定量PCR 單克隆抗體制備 帕金森疾病模型
        免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗體制備 抑郁癥動物模型
        ELISA(酶聯免疫吸附法)技術 Western-blot 實驗服務 脊髓損傷模型
        生化指標檢測 蛋白雙向電泳實驗服務 腦外損傷模型
        雙熒光素酶報告基因檢測 原核蛋白表達純化 骨神經損傷模型
        染色質免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表達純化 心肌缺血模型
        GST pull Down ITRAQ定量蛋白質組學 心力衰竭模型
        SLAC蛋白組學 肺動脈高血壓動物模型
        高血壓模型
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        過表達/干擾慢病毒包裝純化 整體課題外包 大腦中動脈阻塞模型
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        HE染色 多基因敲除細胞系 mRNA芯片
        免疫組化 目的基因敲入細胞系 甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
        Tunel(原位末端凋亡法)檢測 報告基因敲入細胞系 SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
        激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除細胞系
        免疫熒光
        Masson染色 CRISPR/Cas9動物敲除/敲入
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        熒光原位雜交 基因敲入大鼠/小鼠
        特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)
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