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        原代細胞培養
        脂肪/骨髓/牙源間充質干細胞

        時間:2020-07-17 16:29:00 瀏覽:3442次


        威斯騰生物經過10多年的發展,獲得了上百種細胞株和四十余種原代細胞培養經驗,并建立了龐大的細胞庫及原代培養資料庫。細胞平臺有資深實驗員、規范的SOP操作文件,萬級凈化細胞房,這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時,威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養經驗,結合平臺已有的技術優勢,建立了完善的體外藥篩實驗,并引進RTCA(Real-time cellular Analysis,實時無標記細胞記錄儀),在藥篩過程中,全程實時記錄細胞真實狀況,為藥篩提供最真實精準的實驗數據。

        大鼠骨髓間充質干細胞的分離

        操作方法

        (1)取SD大鼠(2周齡),頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡,移入超凈工作臺內,用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

        (2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨,剔除骨頭表面肌肉,PBS溶液沖洗兩遍。

        (3)從中間剪斷股骨和脛骨,用2ml無菌注射器吸取DMEM/F12溶液沖出骨髓細胞多次,再用針頭吹打,吸管吸入離心管內,1000r/min離心5min,棄上清,用PBS重懸細胞。

        (4)緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內,保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層,注意不要攪動液面,保持二者分層界面。

        (5)2000rpm離心15-25min,離心后溶液分4層,吸取中間骨髓基質細胞層(白色渾濁狀),PBS洗三次。

        (6)用含15%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM/F12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中,置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

        (7)24小時后棄去培養液(看細胞貼壁情況),PBS沖洗 2-3次去除未貼壁細胞,加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次,一般10d細胞生長融合。

        (8)經0.25%胰酶消化,1:2傳代,其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

        細胞形態

        骨髓間充質細胞原代培養過程中,約24小時即可出現貼壁生長,細胞呈圓形、梭形、三角形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯,出現以梭形為主的多種形態,10-14天70%-80%可融合達到傳代標準。傳代細胞形態單一,呈梭形或扁平型,增殖至細胞融合時呈漩渦狀和放射狀排列。


        大鼠脂肪間充質干細胞的分離

        操作步驟

        1. 取大鼠,使用7%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉,在無菌條件下迅速取出脂肪組織。
        2. 用含1%青鏈雙抗的D-Hank’s 液沖洗3次。剝離脂肪組織上的血管。
        3. 將脂肪組織剪碎,直到組織變為液體狀,加入8-10mL 胰酶,37℃消化90min。
        4. 消化完成后,加入等量含血清DMEM 培養基終止消化,過200目篩網去除大塊組織。
        5. 以1500r/min 離心5min,去上清液,加入含血清DMEM 培養基重懸細胞。

        6. 接種至6 孔板,放入細胞培養箱(37℃,CO2 濃度5%)。細胞穩定培養24h后換液,沖去未貼壁的細胞,更換DMEM培養基(成分同上)繼續培養。以后每2天換液1 次,注意觀察培養基有無渾濁、顏色變淡、漂浮物和絮狀物等

        細胞形態

        大鼠脂肪間充質干細胞培養過程中,約24h即可貼壁生長,細胞呈長梭形生長速度較慢。換液后細胞增殖明顯,出現以長梭形為主的形態,5- 7d 70%-80%可融合達到傳代標準。傳代細胞形態單一,呈長梭形。


        牙源間充質干細胞分離

        操作步驟

        (1)取SD乳大鼠,頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡,移入超凈工作臺內,用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

        (2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀解剖出大鼠已萌的牙根發育中的第一磨牙,沿Hertwig上皮起始處橫切分離出包括根尖乳頭、Hertwig上皮、牙囊的根端復合體,PBS溶液沖洗兩遍。

        (3)組織塊剪碎,然后采用酶消化法消化培養,單細胞懸液以1X105細胞/ml在加了15%胎牛血清及青鏈霉素的a-MEM培養基中,置37℃、5%CO2恒溫培養箱進行培養。

        (4)24小時后棄去培養液(看細胞貼壁情況),PBS沖洗 2-3次去除未貼壁細胞,加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次,一般10d細胞生長融合。

        (5)經0.25%胰酶消化,1:2傳代,其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

        細胞形態

        牙源間充質細胞原代培養過程中,約24小時即可出現貼壁生長,細胞呈圓形、梭形、三角形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯,出現以梭形為主的多種形態,10-14天70%-80%可融合達到傳代標準。傳代細胞形態單一,呈梭形或扁平型,增殖至細胞融合時呈漩渦狀和放射狀排列。


        威斯騰實驗服務流程


        威斯騰生物服務項目

        分子生物學檢測 蛋白質與免疫學 動物實驗
        實時熒光定量PCR 單克隆抗體制備 帕金森疾病模型
        免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗體制備 抑郁癥動物模型
        ELISA(酶聯免疫吸附法)技術 Western-blot 實驗服務 脊髓損傷模型
        生化指標檢測 蛋白雙向電泳實驗服務 腦外損傷模型
        雙熒光素酶報告基因檢測 原核蛋白表達純化 骨神經損傷模型
        染色質免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表達純化 心肌缺血模型
        GST pull Down ITRAQ定量蛋白質組學 心力衰竭模型

        SLAC蛋白組學 肺動脈高血壓動物模型


        高血壓模型
        病毒包裝 實驗課題整體外包 粥樣動脈硬化模型
        過表達/干擾慢病毒包裝純化 整體課題外包 大腦中動脈阻塞模型
        過表達/干擾腺病毒包裝純化 細胞整體實驗外包 慢性之氣管炎模型
        逆轉錄病毒包裝純化 動物整體實驗外包 過敏性哮喘模型
        腺相關病毒包裝純化
        肺炎大鼠模型


        肝炎-肝硬化-肝癌模型
        蛋白芯片 原代細胞培養 肝纖維化模型
        細胞因子芯片 骨髓間充質干細胞培養 膽結石模型
        BioPlex懸浮芯片 脂肪干細胞培養 急性胰腺炎模型
        生長因子芯片 心肌成纖維細胞培養 急性腎衰竭模型
        炎癥因子芯片 軟骨細胞培養 體內血栓模型
        血管生成因子芯片 血管內皮細胞培養 關節炎模型
        凋亡因子芯片 神經元細胞培養 I型和II型糖尿病模型
        趨化因子芯片 內皮組細胞原代培養 裸鼠成瘤
        HuProt TM 20K人類蛋白組芯片
        基因編輯動物

        電生理相關服務 動物整體實驗服務

        膜片鉗實驗
        細胞生物學檢測 高通量測序 代謝組學
        細胞原代培養 mRNA測序 氣相色譜GC/MS
        MTT檢測 LncRNA測序 液相色譜LC/MS
        細胞凋亡檢測 全基因組測序 核磁共震NMR
        細胞周期檢測 RNA-Seq測序
        細胞克隆形成實驗 外顯子測序 影像學相關實驗
        Transwell細胞遷移/侵襲 16s擴增子測序 Micro-CT
        流式分選 Small RNA測序 小動物活體成像
        CCK8/XTT檢測 宏基因組測序 核磁共振
        臺盼藍檢測細胞活性 單細胞測序 PET-CT
        藥物篩選細胞學實驗 circleRNA測序
        細胞粘附性檢測 甲基化測序 基因編輯動物
        細胞劃痕實驗
        條件性敲除小鼠/大鼠
        細胞生物學整體實驗
        全基因敲除小鼠/大鼠
        細胞成管實驗

        病理檢測 CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入 基因芯片
        掃描電鏡 基因定點突變細胞系 LncRNA芯片
        透射電鏡 單基因敲除細胞系 miRNA芯片
        HE染色 多基因敲除細胞系 mRNA芯片
        免疫組化 目的基因敲入細胞系 甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
        Tunel(原位末端凋亡法)檢測 報告基因敲入細胞系 SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
        激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除細胞系
        免疫熒光

        Masson染色 CRISPR/Cas9動物敲除/敲入
        原位雜交 基因敲除大鼠/小鼠
        熒光原位雜交 基因敲入大鼠/小鼠
        特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)

        行為學檢測 藥物篩選服務項目 藥效學評價
        曠場實驗 高通量自動藥物篩選平臺 抗腫瘤藥物藥效學評價
        重復性刻板行為檢測 細胞高內涵藥物篩選平臺 心血管系統藥物藥效學評價
        動物跑臺檢測 蛋白質組學靶標研發平臺 泌尿系統藥物藥效學評價
        強迫游泳 分子藥理研究平臺 內分泌系統藥物藥效學評價

        生物膜片鉗藥物篩選平臺 抗炎免疫藥物藥效學評價

        常規藥物體外篩選

        【本平臺合作項目】

        分子生物學、細胞生物學、基因敲出/入、模式動物、SPF動物保種、病理學檢測、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產權服務!

        【全國免費熱線】400-675-6758
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